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title: Labo* SNP-array** Interpretation*** Htz/hmzon peut regarder la fréquence des allèles Bnormal = 3 bandes (AA -> 0, AB -> 0.5, BB -> 1)deletion htz = 0 bandes (plus de B)duplication htz = 4 bandes (AA -> 0, AAB -> 1/3, ABB -> 2/3, BBB -> 1)perte d’htz avec nombre de copie normale = pas de bande*** Nombre de copiesnormal = 2* Caryo** TODO Transloc Robertsonien* Principales techniques d’analyse des anormalies génétiques à l’échelle du gène (Collège)** Extraction- ADN: tissu frais, congelés (Guthrie, frottis, cheveuxx..). Habituellement : leucocycte du sang sur tube anticoagulant- NARN: cellules en culture, tissus à -80 ou tissus fraisPhénol/chloroforme = référenceConservation- ADN purifié : 4°- ARN : -80Qualité : éléctrophorèse (2 bandes pour ARN, 1 bande pour ADN)** Enzymes de restrictionCoupe ADN double brin sur séquences spécifiques** Polymérases*** ADN polymérases3 types de réactions1. construit ADN à partir d’un brin d’ADN + extrémité 3’OH libre2. proofreading (sens inverse)3. élimine fragment appariés*** ARN dépendantes (transcriptase inverse)ARNm -> ADN complétentaire** ÉlectrophorèseAciden nucléique = macromolécule chargées -> migrent dans un champ électriquePlus le fragment d’ADN est petit, plus il migre haut** Southern blotÉtude d’un fragment d’ADN -> semi-quantitatif -> peut mettre en évidence- délétions/insertions > 150-300pb- inversions- cartographies de restrictions*** MéthodeADN digéré par des enzymes de restrictionsFragments séparés par du gel d’agaroseAjout sonde spécifique puis lavage pour enlever les séquences non spécifiques** Northern BlotSouthern Blot mais sur ARNMontre- absence/diminution ARNm (réarrangements majeurs, mutation promoteur, anomalies transcription/transcrit instable)- taille- transcrits alternatifs** PCRAmplification d’une courte séquence d’ADN pour avoir une grande quantité de matériel nucléique*** Méthode1. Dénaturation : en chauffant, ADN double brin -> simble brin2. Hybridation amorces complémentaires (identifie la région à amplifier)3. Polymérisation: avec ADN polymérase ADN dépendantes, on reconstitue ADN double brinOn répéte la technique pour avoir $N_0 (1+\epsilon)˰n$ matériel où $\epsilon$ est le rendementVérification de la qualité par électrophorèse*** RT-PCRIdem mais pour ARN. Permet** SangerOn part d’un ADN simple brin. Puis synthèse du brin complémentaire mais en remplacant les dNTP par des ddNTP.Les ddNTP sont intégrés au hasard et arrḙtent la formation de la chaine.On obtient des fragments de différentes tailles, séparés par électrophorèse.Les ddNTP sont couplés à des molécules fluorescentes -> chaque bande aura une couleur spécifique du nucléotideAvantages: séquences plus longues que le NGS (700pb) avec très peu d’erreur-> utilisé pour valider résultat* Structure d’analyse de remaniement (ou variants)1. Quel impact sur ARN message ?2. Quel impact sur la protéine ? (utiliser PFAM)* Cytogénétique** Villosités chorialescontiennent 2 type de tissus- extra-embryonnaire cytotrophoblastes et syncytiotropblaste- embryonnaire: mésenchymeExamen direct : sur cytotrophoblastes -> rapide mais toujours à confirmer par une culture sur mésenchyme*** LimitesXX: possibilité d’une contamination maternelleCytotrophoblastiques : mosaique, pas assez de mitoses, anomale déséquilibréeSource [[http://www.eaclf.org/docs/GBPcyto/Arbre-caryoVC.pdf][Recos EACLF]]* VariantTransmission- AD = perte de fonction x 1, gain de fonction "toxique"- AR = perte de fonction x1- Dominant négatif : gain de fonction mais impacte l’allèle saine -> pas de protéine- Lié à l’XNMD: coupe l’ARN si protéine trop courte (codon stop prématuré) = mécanisme de contrôleNB: il existe 3 synonymes pour un codon stopVariant- faux-sens = peut tout donner !- stop et frameshift = perte de fonctionNB: attention aux codons qui sont répartis sur 2 exons* Anomalies génétiques à l’échelle du gène (Collège)** Types :*** substitution nucléotidiqueTransitions [fn:1] 2x plus fréquentes que les transversions (l’inverse des transversion). Contre-intuitif car il y a plus de possibilités de transversion.Probablement du à des incorporations erronnées des ADN polymérases et correction plus efficace si transversionCpG -> TpG ou CpA surrerprésentées*** Petites délétions/insertion- Quelques nucléotides.- Fréquentes- frameshift (non multiple de 3) : codon sto prématuré -> protéine tronquée, la plupart du temps non foncitonnelle- sur de courtes répétitions en tandem, probablement par slippages de l’ADN polymérase*** Grandes délétion/duplications/inversionDu à- Répétitions en tandemde 1 à 4 nuclétodie = hotspot de dérapage réplication-> courtes indel- Low Copy Repeats = dispersées ou dupliquées en tandem- sur le même bras chromosomique et très similaire -> mésappariement possible par NAHR, échange cromatide soeurs ou intrachromatidienne. Voir [[*NAHR (recombinaison homologue non alléliques)][NAHR (recombinaison homologue non alléliques)]]*** Expansion de triplet- Neurodégénératif surtout : Xfra, Steinert, Huntington- Avec les générations : de plus en plus précoce et clinique augment en gravité (=anticipation)- si > 50 répétition, probablement structure anormales (épinges à chevexu, triple hélice) -> perturbe réplication, favorie dérapage*** Rares**** Séquences répétées dispersées :- courtes (300bp)= Alu (apparetenet SINE = short interspede elements)- longue 3-7bk (LINE = long interspede elements)Vont être introductie après la rétrotrnascription d’ARNRares mais décrits l’exon/intron**** Conversion géniquesRégions homoligues proches : transert (unilatéral !) des changements nucléotidiques dans gène receveurEx: /CYP21A2/ recoit du pseudogènes /CYP21AP/ des variants perte de fonction -> 25% des cas de déficiton en 21-hydroxylase (hyperplasie congénitale des surrénale)NB: les 75% % croissing-over inégaux, échanges entre chromatides soeurs*** Réarragements chromosomiques- délétion région (phénotype des gènes contigus)- Point de cassure dans le gène (très rare)- disomie uniparentale : si empreinte, ou révèle patho récessive*** MosaïquesDe novo : 33% des Duchenne, hémophile, 50% des NF1, 90% pour achondroplasie[[file:img/mosaique1.png]][[file:img/mosaique2.png]]** Conséquences[[file:img/mutation.png]]*** Perte de fonctionAlléle- amorphe/muls = 0 expression de la protéine, ou protéine totalement inactive- hypomorphie = expression partielle ou protéine partiellement inactiveRetrouvé dans les maladies récessive ou dominantes avec haplo-insuffisance (ex: hypercholéstérolémie familiale : htz = moins sévère que hmz)**** Affecte la régulationEn cis :- promoteur : altère un site consensus de liaisons à un facteur de transcription, diminue expression du gène, modifie la structure du promoteur- enhancers, silencers : fix facteurs de transcription et activite/inhibe transcription- effet de position : le ène est séparé de ses régulateurs ou placé près d’autre rélugateurs (ex: transloc)- deletion des Locus Control Region: grande taille, effet très loin (ex: deletion pour β-thalassémie)En trans: gènes codants facteurs de trnascription. Le plus souvent létal. Ex : /MECP2/ (sd de Rett) : abolition de la régulation négative**** ÉpissageVoir [[file:bio.org::*Intron][la liste des possibilités]]exX mutation signal de polyadénylation de /HBA2/ (code α2globine) pour α-thalasémie**** Traduction- Non-sens, frameshift, codon d’initiation de la traduction -> pas de protéine ou activité fonctionnelle nulle/très réduite en général- conséquence possibe : dégradation ARNm par NMD- faux-sens : peut affecter la stabilité, adressage intracellulaire, maturation de la protéine, son assemblage, interfaction avec ligand/protéine- synonyme : déléter dans une minorité (altération épissage)NB: défiit G6PD : que des faux sens car la perte totale de fonction est létale- mutation des gones de la chromatine: ex /EZH2/ dans[[file:maladies.org::*Syndrome de Weaver][Syndrome de Weaver]]*** Gain de fonction- effet dominant négatif: ex de l’ostégénose impartafte : mutation htz a un effet plus délétère qu’une perte totale de fonction car empèche association de la sous-unité raccourcie aux chaînes normales- mutation faux-sens p.Met358Arg (/Pttsburg/) sur α1-antitrypsine -> devient un inhibiteur des facteur de coagulation -> sd hémorragique- surexpression: exceptionne en constit (ex: Charcot-Marie-Totthe 1: myélinogenèse anormale), fréquente en oco somatique- Modification des propriété fonctionnellesEx: affinité à l’oxygène diminuée pour l’hémoglobine*** Gain et perte = phénotpe différente- Ex: /RET/: perte = Hirschprung, gain de fonction = cancer familiaux médullaire de la thyro̤¨,de** Diversité- unique : modification fonctionnelle très prècise (protéien, expression du gènes -> drépanocytose, achondroplasie, Huntington, Steinert)- prépondérante : point chaud (hémophiliae A, AMS), effet fondateur (thalassémie)- hétérogènes** Interprétation des variants:- ségrégation : de novo ou coségrégation = en faveur- fréquent chez non atteints- effet sur proténie : région/domaine essentiel (polarité/charge acide amine, encombrement stérique) -> score bioinfo- conservation interespèces- expérience : étude gènes et trnascrite, étude /in vitro/ sur des cellules, /in vivo/* Nouveaux syndromes microdéletionnels- souvent hérité parent asympto- facteur suscepbtibilité/prédisposition aux troubles neurodev- PIEV** 16p11.2i*** del BP4 et BP5 = typique590kb**** Clinique- Difficulté aprentissage ou DI légère, retard langage /develop- épilepsie, dyskinéie déclenché par le mouvement (début 6-15A)- Troubles du comportement : TSA, psy- malfo de Chiari, ectopie amygdale cérébelleuse- FR obésité- macrocéphalie fréquente- scoliose- risque malfo cardiaque**** Labo- de novo 80%- gènes /PRRT2/, /KCDT13/, /TBX6/- varabilité phénotypiuqe**** dup BP4 BP5phénotype en miroir- di- troubles psy : schizo, comportement- faible poids- épilepsieparents asympto*** microdel BP2 et BP3 = atypique220kb- Retard de develop- Hyperactivité- Épilepsie- Obésite précoce40% de novoDu réciproque : status encore incertaine** 15q11.2q13 (hors PraderWilli)*** microdel 15q11.2 BP1 BP2- 500kb- le plus souvent hérité- faible pénétrance- gènes : /TUBGCP5/, /CYFIP1/, /NIPA1/, /NIPA2/**** CliniqueRetard de dev, moteur, langageHyperactivitéTrouble attention, TSA+/- épi*** micro del 15q13.3- 2Mb le plus souvente- héritée 85%**** Clinique- DI- retard langage,- trouble comporteement, hyperactivité- TSA- épi- shizo- hypotonie- rarement cardiopathie**** Dup réciproquestatus incertaine** 22q11.2LCR -> déliminte région proximale centrale distale*** Centrale- /CRKL/***** Clinique- retard croissance- retard dev, langage- dysmorphie faciale- malfo génito-uriaine, cardiaque- trouble psy*** Distance type 1Clinique- retard croissance- retard dev, langage- dysmorphie faciale- malfo cardiaqueRisque préma et complication obstétricale !*** Distance type 3- SMARC1BClinique- Risque rhabdomosacrome- retard dev/DI- microcéphalie- malfo cardiaque* Remaniement subtélomériques- Région de transition avant répétition télomériques- Complexe et variable- Séquences répétées + uniques- Taille variable entre les chr et individus** Fonction- Non indispensable pour viabilité ou ségrég- Réservoir de ènes ?- Barrière contre effet de position télomérique (diffusion hétérochromatine)** MicrodelMécanismes: aléatoireY penser si- DI- histoire familiale DI- retard de croissance- dysmorphie faciale- malfoDiag sur FISH, MLPA, ACPA- gain et perte terminale en ACPA -> y penser et FISH + caryo parent pour transloc équilbrée** Syndromes- [[file:maladies.org::*Syndrome de Wolf-Hirschhorn][Syndrome de Wolf-Hirschhorn]]- [[file:maladies.org::*Syndrome du cri du chat][Syndrome du cri du chat]]- [[file:maladies.org::*Deletion 1qter][Deletion 1qter]]- [[file:maladies.org::*Monosomie 1p36][Monosomie 1p36]]- [[file:maladies.org::*Syndrome Kleefstra/Deletion 9qter][Syndrome Kleefstra/Deletion 9qter]]- [[file:maladies.org::*Délétion 2qter][Délétion 2qter]]* Réarrangements génomiquesDuplication, deletion, insertion, inversion, translocationmicro si < 5Mb2 types- Récurrents = taille et position identiques chez patients avec même syndromes- Non-récurrents = variable mais région commune entre tous les remaniementsDans les cellules germinales (méiose) -> constitDans les cellules somatique (mitose/mosaïque) -> cancer** Mécanismes principaux*** NAHR (recombinaison homologue non alléliques)- Principale mécanisme pour réarragement récurrents- Recombinaison homologue = physiologique, sert à réparer les cassures doubles brins de l’ADNappariement strict- Si mauvaise matrice de réparation, se fait alors de manière non allélique- Pendant méiose ou mitoses**** Favorisé par- structures qui génères spontanément des cassures (palindromes)- surtout les LCR (low copy repeat) = 1-400kb avec forte homologie (>90%)- forte concentration dans péricentromère, subtélomère- 20% géne**** Peut arriver- entre 2 chromomosem- sur un même chromosome : entre les 2 bras ou sur le même bras[[file:img/nahr.png]](chromatide soeur)**** SensSi LCR même sense : Deletion/dupSinon : inversion (180% et s’insère à la même place): souvent bénin mais facteur favorisant pour microdel/dup dans la descendance (ex: sd de Willams-Burren)**** Hotspotpéricentromérique de centairs chromosomes*** NHEJ (raccordemente d’extrémités non homologues)- Réparer cassures doubles brins, prédominant chez les mammifères- Ici actif tout au long du cycle cellulaire- Pas d’homologie nécessaire ici ! mécanisme biochimique- Réarrangement non récurrentsImpliqué dans les recombinaisons physiologique (immunité)Patho: cancer*** État final :- réparation- ou séquence "cicatrice" suite modification oligonucléotide- délétion- insertion- MMEJ (microhomology-mediated end joining)(Erreurs d’autant plus fréquentes qu’il y a des micro-homologie)*** Réplication- FoSTeS (fork stalling and template switching) ou MMBBIR (microhomology-mediated break-induced replication)- Non lié à la réparation !- Réarrangement non récurrent complexes- Impliqué : sd de Pelizaeus-Merzbacher*** FostesFourche de répilcation parfois arrêtés par des structures particulières (ex: lésions sur ADN, collision avec complexe de transcription)-> si passe outre, cassure brinNormalement corrigé par NH mais peut être perturbé par micro-homologie -> nouvelle fourche de réplication*** MMBIRIdem mais déclenché par cassure double brin sur la fource, (du à une cassure simple )** favorisé par- structures secondaires augmentant la fréquence des cassures adn- Séquences avec forte homologies (LCR, Alu)- Stress cellulaireposition dans le noyau (territoire chromosomique)* Microremaniements génomiquesClassique : définition initiale clinique- Miller-Dieker- [[file:maladies.org::*Syndrome de Wolf-Hirschhorn][Syndrome de Wolf-Hirschhorn]]- [[file:maladies.org::*Syndrome de Smith-Magenis][Syndrome de Smith-Magenis]]- [[file:maladies.org::*Syndrome de Prader-Willi][Syndrome de Prader-Willi]]- [[file:maladies.org::*Syndrome de Williams-Burren][Syndrome de Williams-Burren]]- [[file:maladies.org::*Syndrome du cri du chat][Syndrome du cri du chat]]Définition d’abord génétiques- Potock-LupskiSi del, sera hétérozygoteSi dup, sera hétérozygoteContient /PMP22/ (code myéline périph)Encadré par 2 LCR -> délétion/insertion par NAHRNeuropathies périphérique démyélinisantes par effet dosage géniques- [[file:maladies.org::*Charcot-Marie Tooth 1A][Charcot-Marie Tooth 1A]]- [[file:maladies.org::*Neuropathie héréditaire sensible à la pression][Neuropathie héréditaire sensible à la pression]]** Région 17p11.23 LCR avec /RAI1/ (facteur de transcription pour message ARN -ADN -> multiples fonction [neuro, os, métabolisme, rythme circadien])NAHR -> délétion/duplication[[file:maladies.org::*Syndrome de Smith-Magenis][Syndrome de Smith-Magenis]]Surexpression :[[file:maladies.org::*Syndrome de Potocki-Lupski][Syndrome de Potocki-Lupski]]** Région 7q11.23Délétion : [[file:maladies.org::*Syndrome de Williams-Burren][Syndrome de Williams-Burren]]Dup [[file:maladies.org::*Microduplication 7q11.23][Microduplication 7q11.23]]* Footnotes[fn:1] C<->T ou A <-> G* Variants d’épissageSi site canonique : -1 ou -2 en accpteur, +1 ou +2 en donner -> pathoSinon, utiliser Spip et SpliceAI. Proposition d’algorithme par ACNMG- les 2 sont négatifs -> on ne fait rien- les 2 sont positifs -> RNAseq- sinon à discuterRegarder l’image des sites donneurs pour voir les séquences connuesNB: interprétation graphique sur mobidetails de spliceAI : montre la "force"* Score bioinfo** Gène*** pLI et o/e* Design d’amorce1. Variant sur UCS- puis "v d" et choisir 500 autour- Extended DNA Case/Color Options: "underline" pour repeate masker et "toggle case" pour gènes UCSC2. Amplifix- copier séquences- Ne pas prendre des amorces > 21 bp pour éviter des températures trop élevées- Chercher de 1-450 (sens) 550-1000 pour commencer- Ne pas prendre un amplicon de plus de 700 (max 750 !!)- Longueurs 19-213. Vérification- [[https://genetools.org/SNPCheck/snpcheck.htm][dbSNP]]- [[https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/primertool.cgi][Primer-BLast]]: mettre forward et revers + choisir génome- [[https://genome-euro.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr][PCR in silico]]- calculer la température** NotesNB: sur UCSC, "tools->blat" pour vérifier la séquence d’ADNSur les amorces, majuscules pour exon, minuscules intron** Attention- longueur grand max 750bp- si taux GC >= 65, il faut une polymérase spécifique avec un calcul de Tm différent-> https://tmcalculator.neb.com/#!/main et oneTaq- Δt <= 6% sur le Tm calculé !** Astuces- In silico PCR: plusieurs résultats possibles sur l’X -> prendre HG38 (car correctif)- Si difficile de prendre l’exon, dans amplifix prendre la borne de l’exon et chercher une amorce à partir de cette borne + 5bp. En baissant un peu la qualité** Région 17p12- [[file:maladies.org::*Microdélétion 22q11.2][Microdélétion 22q11.2]]- Gène /CHRNA7/- microcéphalie,Voir [[file:bio.org::*Intron][Intron]][[file:img/sanger.png]]- transcript anormaux (mutation d’épissage)[[file:img/pcr.png]]** Marqueur NOR"Tige" sur les acrocentrique = gènes pour ribosomesSi doute sur la tige qui apparaît trop longue, on peut utiliser en FISH le marqueur NOR qui va confirmer que c’est bien une tige.Le piège est de le rendre comme polymorphisme alors qu’il s’agit d’une insertion d’un autre chromosome...NOR car intervient dans le nucléole (maturation des ARN ribosomiques)Si "tige" longue, on peut supposer que c’est un facteur de risque pour translocation robertsonienne !
* DéfinitionPénétriance = nb d’individus malades avec génotyp à risque / nb individus avec génotype à risque* Épigénétique
** Définition*** Pénétrancenb d’individus malades avec génotyp à risque / nb individus avec génotype à risque*** Low copy repeat1-400kb avec forte homologie (>90%)** Épigénétique
* Cytogénétique** Villosités chorialescontiennent 2 type de tissus- extra-embryonnaire cytotrophoblastes et syncytiotropblaste- embryonnaire: mésenchymeExamen direct : sur cytotrophoblastes -> rapide mais toujours à confirmer par une culture sur mésenchyme*** LimitesXX: possibilité d’une contamination maternelleCytotrophoblastiques : mosaique, pas assez de mitoses, anomale déséquilibréeSource [[http://www.eaclf.org/docs/GBPcyto/Arbre-caryoVC.pdf][Recos EACLF]]** Caryotype** TODO Transloc Robertsonien** Marqueur NOR"Tige" sur les acrocentrique = gènes pour ribosomesSi doute sur la tige qui apparaît trop longue, on peut utiliser en FISH le marqueur NOR qui va confirmer que c’est bien une tige.Le piège est de le rendre comme polymorphisme alors qu’il s’agit d’une insertion d’un autre chromosome...NOR car intervient dans le nucléole (maturation des ARN ribosomiques)Si "tige" longue, on peut supposer que c’est un facteur de risque pour translocation robertsonienne !* Moléculaire** Principales techniques d’analyse des anormalies génétiques à l’échelle du gène (Collège)*** Extraction- ADN: tissu frais, congelés (Guthrie, frottis, cheveuxx..). Habituellement : leucocycte du sang sur tube anticoagulant- NARN: cellules en culture, tissus à -80 ou tissus fraisPhénol/chloroforme = référenceConservation- ADN purifié : 4°- ARN : -80Qualité : éléctrophorèse (2 bandes pour ARN, 1 bande pour ADN)*** Enzymes de restrictionCoupe ADN double brin sur séquences spécifiques*** Polymérases**** ADN polymérases3 types de réactions1. construit ADN à partir d’un brin d’ADN + extrémité 3’OH libre2. proofreading (sens inverse)3. élimine fragment appariés**** ARN dépendantes (transcriptase inverse)ARNm -> ADN complétentaire*** ÉlectrophorèseAciden nucléique = macromolécule chargées -> migrent dans un champ électriquePlus le fragment d’ADN est petit, plus il migre haut*** Southern blotÉtude d’un fragment d’ADN -> semi-quantitatif -> peut mettre en évidence- délétions/insertions > 150-300pb- inversions- cartographies de restrictions**** MéthodeADN digéré par des enzymes de restrictionsFragments séparés par du gel d’agaroseAjout sonde spécifique puis lavage pour enlever les séquences non spécifiques*** Northern BlotSouthern Blot mais sur ARNMontre- absence/diminution ARNm (réarrangements majeurs, mutation promoteur, anomalies transcription/transcrit instable)- taille- transcrits alternatifs*** PCRAmplification d’une courte séquence d’ADN pour avoir une grande quantité de matériel nucléique[[file:img/pcr.png]]**** Méthode1. Dénaturation : en chauffant, ADN double brin -> simble brin2. Hybridation amorces complémentaires (identifie la région à amplifier)3. Polymérisation: avec ADN polymérase ADN dépendantes, on reconstitue ADN double brinOn répéte la technique pour avoir $N_0 (1+\epsilon)˰n$ matériel où $\epsilon$ est le rendementVérification de la qualité par électrophorèse**** RT-PCRIdem mais pour ARN. Permet- transcript anormaux (mutation d’épissage)*** Sanger[[file:img/sanger.png]]On part d’un ADN simple brin. Puis synthèse du brin complémentaire mais en remplacant les dNTP par des ddNTP.Les ddNTP sont intégrés au hasard et arrḙtent la formation de la chaine.On obtient des fragments de différentes tailles, séparés par électrophorèse.Les ddNTP sont couplés à des molécules fluorescentes -> chaque bande aura une couleur spécifique du nucléotideAvantages: séquences plus longues que le NGS (700pb) avec très peu d’erreur-> utilisé pour valider résultat** SNP-array*** Interpretation**** Htz/hmzon peut regarder la fréquence des allèles Bnormal = 3 bandes (AA -> 0, AB -> 0.5, BB -> 1)deletion htz = 0 bandes (plus de B)duplication htz = 4 bandes (AA -> 0, AAB -> 1/3, ABB -> 2/3, BBB -> 1)perte d’htz avec nombre de copie normale = pas de bande**** Nombre de copiesnormal = 2** Anomalies génétiques à l’échelle du gène (Collège)*** Types :**** substitution nucléotidiqueTransitions [fn:1] 2x plus fréquentes que les transversions (l’inverse des transversion). Contre-intuitif car il y a plus de possibilités de transversion.Probablement du à des incorporations erronnées des ADN polymérases et correction plus efficace si transversionCpG -> TpG ou CpA surrerprésentées**** Petites délétions/insertion- Quelques nucléotides.- Fréquentes- frameshift (non multiple de 3) : codon sto prématuré -> protéine tronquée, la plupart du temps non foncitonnelle- sur de courtes répétitions en tandem, probablement par slippages de l’ADN polymérase**** Grandes délétion/duplications/inversionDu à- Répétitions en tandemde 1 à 4 nuclétodie = hotspot de dérapage réplication-> courtes indel- Low Copy Repeats = dispersées ou dupliquées en tandem- sur le même bras chromosomique et très similaire -> mésappariement possible par NAHR, échange cromatide soeurs ou intrachromatidienne. Voir [[*NAHR (recombinaison homologue non alléliques)][NAHR (recombinaison homologue non alléliques)]]**** Expansion de triplet- Neurodégénératif surtout : Xfra, Steinert, Huntington- Avec les générations : de plus en plus précoce et clinique augment en gravité (=anticipation)- si > 50 répétition, probablement structure anormales (épinges à chevexu, triple hélice) -> perturbe réplication, favorie dérapage**** Rares***** Séquences répétées dispersées :- courtes (300bp)= Alu (apparetenet SINE = short interspede elements)- longue 3-7bk (LINE = long interspede elements)Vont être introductie après la rétrotrnascription d’ARNRares mais décrits l’exon/intron***** Conversion géniquesRégions homoligues proches : transert (unilatéral !) des changements nucléotidiques dans gène receveurEx: /CYP21A2/ recoit du pseudogènes /CYP21AP/ des variants perte de fonction -> 25% des cas de déficiton en 21-hydroxylase (hyperplasie congénitale des surrénale)NB: les 75% % croissing-over inégaux, échanges entre chromatides soeurs**** Réarragements chromosomiques- délétion région (phénotype des gènes contigus)- Point de cassure dans le gène (très rare)- disomie uniparentale : si empreinte, ou révèle patho récessive**** MosaïquesDe novo : 33% des Duchenne, hémophile, 50% des NF1, 90% pour achondroplasie[[file:img/mosaique1.png]][[file:img/mosaique2.png]]*** Conséquences[[file:img/mutation.png]]**** Perte de fonctionAlléle- amorphe/muls = 0 expression de la protéine, ou protéine totalement inactive- hypomorphie = expression partielle ou protéine partiellement inactiveRetrouvé dans les maladies récessive ou dominantes avec haplo-insuffisance (ex: hypercholéstérolémie familiale : htz = moins sévère que hmz)***** Affecte la régulationEn cis :- promoteur : altère un site consensus de liaisons à un facteur de transcription, diminue expression du gène, modifie la structure du promoteur- enhancers, silencers : fix facteurs de transcription et activite/inhibe transcription- effet de position : le ène est séparé de ses régulateurs ou placé près d’autre rélugateurs (ex: transloc)- deletion des Locus Control Region: grande taille, effet très loin (ex: deletion pour β-thalassémie)En trans: gènes codants facteurs de trnascription. Le plus souvent létal. Ex : /MECP2/ (sd de Rett) : abolition de la régulation négative***** ÉpissageVoir [[file:bio.org::*Intron][la liste des possibilités]]exX mutation signal de polyadénylation de /HBA2/ (code α2globine) pour α-thalasémie***** Traduction- Non-sens, frameshift, codon d’initiation de la traduction -> pas de protéine ou activité fonctionnelle nulle/très réduite en général- conséquence possibe : dégradation ARNm par NMD- faux-sens : peut affecter la stabilité, adressage intracellulaire, maturation de la protéine, son assemblage, interfaction avec ligand/protéine- synonyme : déléter dans une minorité (altération épissage)NB: défiit G6PD : que des faux sens car la perte totale de fonction est létale- mutation des gones de la chromatine: ex /EZH2/ dans[[file:maladies.org::*Syndrome de Weaver][Syndrome de Weaver]]**** Gain de fonction- effet dominant négatif: ex de l’ostégénose impartaite : mutation htz a un effet plus délétère qu’une perte totale de fonction car empèche association de la sous-unité raccourcie aux chaînes normales- mutation faux-sens p.Met358Arg (/Pttsburg/) sur α1-antitrypsine -> devient un inhibiteur des facteur de coagulation -> sd hémorragique- surexpression: exceptionne en constit (ex: Charcot-Marie-Totthe 1: myélinogenèse anormale), fréquente en oco somatique- Modification des propriété fonctionnellesEx: affinité à l’oxygène diminuée pour l’hémoglobine**** Gain et perte = phénotpe différente- Ex: /RET/: perte = Hirschprung, gain de fonction = cancer familiaux médullaire de la thyro̤¨,de*** Diversité- unique : modification fonctionnelle très prècise (protéien, expression du gènes -> drépanocytose, achondroplasie, Huntington, Steinert)- prépondérante : point chaud (hémophiliae A, AMS), effet fondateur (thalassémie)- hétérogènes*** Guide à l’interprétation des variants:- Quel impact sur ARN message ?- Quel impact sur la protéine ? (utiliser PFAM)- Outils d’aides- Franklin- Decipher- Varsome- Utiliser algorithme ACMGAutres critères- fréquent chez non atteints- effet sur proténie : région/domaine essentiel (polarité/charge acide amine, encombrement stérique) -> score bioinfo- conservation interespèces- expérience : étude gènes et trnascrite, étude /in vitro/ sur des cellules, /in vivo/- ségrégation : de novo ou coségrégation = en faveurVoir [[file:bio.org::*Intron][Intron]]- faux-sens = peut tout donner !- stop et frameshift = perte de fonctionNB: attention aux codons qui sont répartis sur 2 exons*** Transmission- AD = perte de fonction x 1, gain de fonction "toxique"- AR = perte de fonction x1- Dominant négatif : gain de fonction mais impacte l’allèle saine -> pas de protéine- Lié à l’XNMD: coupe l’ARN si protéine trop courte (codon stop prématuré) = mécanisme de contrôleNB: il existe 3 synonymes pour un codon stop** Nouveaux syndromes microdéletionnels- souvent hérité parent asympto- facteur suscepbtibilité/prédisposition aux troubles neurodev- PIEV*** 16p11.2i**** del BP4 et BP5 = typique590kb***** Clinique- Difficulté aprentissage ou DI légère, retard langage /develop- épilepsie, dyskinéie déclenché par le mouvement (début 6-15A)- Troubles du comportement : TSA, psy- malfo de Chiari, ectopie amygdale cérébelleuse- FR obésité- macrocéphalie fréquente- scoliose- risque malfo cardiaque***** Labo- de novo 80%- gènes /PRRT2/, /KCDT13/, /TBX6/- varabilité phénotypiuqe***** dup BP4 BP5phénotype en miroir- di- troubles psy : schizo, comportement- microcéphalie,- faible poids- épilepsieparents asympto**** microdel BP2 et BP3 = atypique220kb- Retard de develop- Hyperactivité- Épilepsie- Obésite précoce40% de novoDu réciproque : status encore incertaine*** 15q11.2q13 (hors PraderWilli)**** microdel 15q11.2 BP1 BP2- 500kb- le plus souvent hérité- faible pénétrance- gènes : /TUBGCP5/, /CYFIP1/, /NIPA1/, /NIPA2/***** CliniqueRetard de dev, moteur, langageHyperactivitéTrouble attention, TSA+/- épi**** micro del 15q13.3- Gène /CHRNA7/- 2Mb le plus souvente- héritée 85%***** Clinique- DI- retard langage,- trouble comporteement, hyperactivité- TSA- épi- shizo- hypotonie- rarement cardiopathie***** Dup réciproquestatus incertaine*** 22q11.2LCR -> déliminte région proximale centrale distale**** Centrale- /CRKL/****** Clinique- retard croissance- retard dev, langage- dysmorphie faciale- malfo génito-uriaine, cardiaque- trouble psy**** Distance type 1Clinique- retard croissance- retard dev, langage- dysmorphie faciale- malfo cardiaqueRisque préma et complication obstétricale !**** Distance type 3- SMARC1BClinique- Risque rhabdomosacrome- retard dev/DI- microcéphalie- malfo cardiaque** Remaniement subtélomériques- Région de transition avant répétition télomériques- Complexe et variable- Séquences répétées + uniques- Taille variable entre les chr et individus*** Fonction- Non indispensable pour viabilité ou ségrég- Réservoir de ènes ?- Barrière contre effet de position télomérique (diffusion hétérochromatine)*** MicrodelMécanismes: aléatoireY penser si- DI- histoire familiale DI- retard de croissance- dysmorphie faciale- malfoDiag sur FISH, MLPA, ACPA- gain et perte terminale en ACPA -> y penser et FISH + caryo parent pour transloc équilbrée*** Syndromes- [[file:maladies.org::*Syndrome de Wolf-Hirschhorn][Syndrome de Wolf-Hirschhorn]]- [[file:maladies.org::*Syndrome du cri du chat][Syndrome du cri du chat]]- [[file:maladies.org::*Deletion 1qter][Deletion 1qter]]- [[file:maladies.org::*Monosomie 1p36][Monosomie 1p36]]- [[file:maladies.org::*Syndrome Kleefstra/Deletion 9qter][Syndrome Kleefstra/Deletion 9qter]]- [[file:maladies.org::*Délétion 2qter][Délétion 2qter]]** Réarrangements génomiquesDuplication, deletion, insertion, inversion, translocationmicro si < 5Mb2 types- Récurrents = taille et position identiques chez patients avec même syndromes- Non-récurrents = variable mais région commune entre tous les remaniementsDans les cellules germinales (méiose) -> constitDans les cellules somatique (mitose/mosaïque) -> cancer*** Mécanismes principaux**** NAHR (recombinaison homologue non alléliques)- Principale mécanisme pour réarragement récurrents- Recombinaison homologue = physiologique, sert à réparer les cassures doubles brins de l’ADNappariement strict- Si mauvaise matrice de réparation, se fait alors de manière non allélique- Pendant méiose ou mitoses***** Favorisé par- structures qui génères spontanément des cassures (palindromes)- surtout les [[file:bio.org::*Low copy repeat][Low copy repeat]]- forte concentration dans péricentromère, subtélomère- 20% géne***** Peut arriver- entre 2 chromomosem- sur un même chromosome : entre les 2 bras ou sur le même bras[[file:img/nahr.png]](chromatide soeur)***** SensSi LCR même sense : Deletion/dupSinon : inversion (180% et s’insère à la même place): souvent bénin mais facteur favorisant pour microdel/dup dans la descendance (ex: sd de Willams-Burren)***** Hotspotpéricentromérique de centairs chromosomes**** NHEJ (raccordemente d’extrémités non homologues)- Réparer cassures doubles brins, prédominant chez les mammifères- Ici actif tout au long du cycle cellulaire- Pas d’homologie nécessaire ici ! mécanisme biochimique- Réarrangement non récurrentsImpliqué dans les recombinaisons physiologique (immunité)Patho: cancer**** État final :- réparation- ou séquence "cicatrice" suite modification oligonucléotide- délétion- insertion- MMEJ (microhomology-mediated end joining)(Erreurs d’autant plus fréquentes qu’il y a des micro-homologie)**** Réplication- FoSTeS (fork stalling and template switching) ou MMBBIR (microhomology-mediated break-induced replication)- Non lié à la réparation !- Réarrangement non récurrent complexes- Impliqué : sd de Pelizaeus-Merzbacher**** FostesFourche de répilcation parfois arrêtés par des structures particulières (ex: lésions sur ADN, collision avec complexe de transcription)-> si passe outre, cassure brinNormalement corrigé par NH mais peut être perturbé par micro-homologie -> nouvelle fourche de réplication**** MMBIRIdem mais déclenché par cassure double brin sur la fource, (du à une cassure simple )*** favorisé par- structures secondaires augmentant la fréquence des cassures adn- Séquences avec forte homologies (LCR, Alu)- Stress cellulaireposition dans le noyau (territoire chromosomique)** Microremaniements génomiquesClassique : définition initiale clinique- Miller-Dieker- [[file:maladies.org::*Syndrome de Wolf-Hirschhorn][Syndrome de Wolf-Hirschhorn]]- [[file:maladies.org::*Microdélétion 22q11.2][Microdélétion 22q11.2]]- [[file:maladies.org::*Syndrome de Smith-Magenis][Syndrome de Smith-Magenis]]- [[file:maladies.org::*Syndrome de Prader-Willi][Syndrome de Prader-Willi]]- [[file:maladies.org::*Syndrome de Williams-Burren][Syndrome de Williams-Burren]]- [[file:maladies.org::*Syndrome du cri du chat][Syndrome du cri du chat]]Définition d’abord génétiques- Potock-LupskiSi del, sera hétérozygoteSi dup, sera hétérozygote*** Région 17p12Contient /PMP22/ (code myéline périph)Encadré par 2 LCR -> délétion/insertion par NAHRNeuropathies périphérique démyélinisantes par effet dosage géniques- [[file:maladies.org::*Charcot-Marie Tooth 1A][Charcot-Marie Tooth 1A]]- [[file:maladies.org::*Neuropathie héréditaire sensible à la pression][Neuropathie héréditaire sensible à la pression]]*** Région 17p11.23 LCR avec /RAI1/ (facteur de transcription pour message ARN -ADN -> multiples fonction [neuro, os, métabolisme, rythme circadien])NAHR -> délétion/duplication[[file:maladies.org::*Syndrome de Smith-Magenis][Syndrome de Smith-Magenis]]Surexpression :[[file:maladies.org::*Syndrome de Potocki-Lupski][Syndrome de Potocki-Lupski]]*** Région 7q11.23Délétion : [[file:maladies.org::*Syndrome de Williams-Burren][Syndrome de Williams-Burren]]Dup [[file:maladies.org::*Microduplication 7q11.23][Microduplication 7q11.23]]** Variants d’épissageSi site canonique : -1 ou -2 en accpteur, +1 ou +2 en donner -> pathoSinon, utiliser Spip et SpliceAI. Proposition d’algorithme par ACNMG- les 2 sont négatifs -> on ne fait rien- les 2 sont positifs -> RNAseq- sinon à discuterRegarder l’image des sites donneurs pour voir les séquences connuesNB: interprétation graphique sur mobidetails de spliceAI : montre la "force"** Score bioinfo*** Gène**** pLI et o/e** Guide au design d’amorce1. Variant sur UCS- puis "v d" et choisir 500 autour- Extended DNA Case/Color Options: "underline" pour repeate masker et "toggle case" pour gènes UCSC2. Amplifix- copier séquences- Ne pas prendre des amorces > 21 bp pour éviter des températures trop élevées- Chercher de 1-450 (sens) 550-1000 pour commencer- Ne pas prendre un amplicon de plus de 700 (max 750 !!)- Longueurs 19-213. Vérification- [[https://genetools.org/SNPCheck/snpcheck.htm][dbSNP]]- [[https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/primertool.cgi][Primer-BLast]]: mettre forward et revers + choisir génome- [[https://genome-euro.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr][PCR in silico]]- calculer la température*** NotesNB: sur UCSC, "tools->blat" pour vérifier la séquence d’ADNSur les amorces, majuscules pour exon, minuscules intron*** Attention- longueur grand max 750bp- si taux GC >= 65, il faut une polymérase spécifique avec un calcul de Tm différent-> https://tmcalculator.neb.com/#!/main et oneTaq- Δt <= 6% sur le Tm calculé !*** Astuces- In silico PCR: plusieurs résultats possibles sur l’X -> prendre HG38 (car correctif)- Si difficile de prendre l’exon, dans amplifix prendre la borne de l’exon et chercher une amorce à partir de cette borne + 5bp. En baissant un peu la qualité* Footnotes[fn:1] C<->T ou A <-> G